POCT产品设计:如何改进传统PCR检测技术

疫情对分子诊断行业带来了前所未有的发展机遇,新技术,新产品迭代更新,技术壁垒不断突破,整个行业正在蓬勃发展。

国内分子诊断技术方法学包括分子杂交技术,荧光PCR技术,基因测序技术,生物芯片技术。其中PCR 技术是分子诊断技术中发展时间较长,较为成熟的技术,基于PCR技术的诊断产品在所有分子诊断品类中占比最高,临床上被广泛用于传染病,性病,肿瘤,遗传病的筛查检测,其中传染病检测占大部分市场。

目前,用于检测新冠病毒的PCR分析取得了快速发展。截至2020年4月上旬,各国为了控制疫情积极采取措施颁发了紧急使用授权的28种产品,其中有25种是PCR测试试剂盒。然而,从检测结果来看有一些问题还需要进一步探究。

首先,据报道核酸检测阳性检出率低至30%-60%左右,这表明假阴性率很高。究其原因包括采样错误和临床标本选择不当,病毒载量的个体变化以及各种PCR试剂盒的操作程序差异,错误处理的样品或提取物中存在的PCR抑制剂都会导致假阴性结果。

其次,PCR需要控制特定的温度循环,冷藏试剂存储并且要求经过专业培训的操作人员和特定的实验场所等,这些客观条件也有可能会影响结果。

为了使分子诊断应用到更多的场景中,研究人员也在积极寻找新的方法,改善传统PCR的不足。

即时医疗点(POC)等温扩增技术

尽管PCR是进行COVID-19分子诊断的金标准,但它对热循环仪的要求很高。因此,科学家们尝试使用可替代的指数扩增技术,例如环介导的等温扩增(LAMP),重组酶聚合酶扩增,超支化滚环扩增,指数扩增反应和指数链置换扩增等。在恒温条件下进行反应,不需要热循环,这些指数放大技术激发了POC应用的潜力。其中LAMP提供了可用于检测低拷贝核酸的PCR灵敏度。LAMP通常也适用于POCT仪器,通常在60–65°C的温度下运行,无需进行温度循环即可实现核酸靶标的指数扩增。

结合CRISPR技术的等温扩增

CRISPR诊断平台的先驱-DETECTR,靶向DNA内切核酸酶的CRISPR反转录报告基因,已与LAMP一起使用。基于CRISPR技术的病毒检测等温扩增,首先从患者标本中提取样本,然后将纯化的RNA反转录为cDNA,并通过等温技术来进行扩增。

基于CRISPR的检测可检查等温扩增产物的序列,这比使用非特异性荧光染料或pH指示剂具有更高的分析特异性。等温扩增可在短时间内实现指数扩增,检测可以在30分钟内完成,这对POCT测试和现场分析有很大价值。

改善PCR分析方法

为了提高检测水平,IVD公司开发新的PCR平台,更好的基质效应耐受性以及与更简单或更少的样品来处理诊断过程。其中一个平台就是液滴数字PCR。该技术长期被国外大品牌垄断,导致国内企业一直依赖国外的仪器和试剂,而近些年来,随着本土IVD企业的崛起,陆续研发出本土化数字PCR平台。液滴数字PCR使用与常规PCR相同的引物,探针和试剂,不同之处在于将大量反应溶液分为数千个纳升大小的微滴或分区。设计分区的形成,使得每个分区都包含一个或不包含靶序列。对阳性分区的数量进行计数可得出原始样品中存在的靶标副本总数的结果。

液滴数字PCR的优势是:

一方面,分区有效地减少了模板对引物的竞争。

另一方面,分离的液滴反应器的纳升体积显著增加了目标的局部有效浓度,有利于反应动力学和效率。这两个功能均可保证较低的检测误差。

需要改进的POCT诊断

为了满足对COVID-19进行快速且大规模测试的需要,迫切需要寻找适用于POCT检测的新诊断工具。目前在资源有限的情况下,POCT检测的开发通常面临的以下挑战:

在单个样品中只能存在微量的目标RNA,这需要大量的信号放大;

1.缺乏精密的仪器或温度控制扩增技术;

2.扩增反应产生的信号必须易于检测;

3.必须尽量减少样本处理,以避免操作人员接触病毒,检测最好在单管或密闭隔室中进行,而无需重复打开;

4.测试应易于非专业人员操作,无需大量培训;

5.应当通过对实际临床标本的分析来大力进行POC分析的验证。

最近,等温扩增方法的应用及其与CRISPR技术的结合被科学家们看好,通过等温扩增,可以在恒定温度下快速扩增核酸,而无需进行热循环。以一体化的试剂和自动化的仪器进行新冠病毒的POCT检测,实现一种简单的“样本输入和结果输出”的POCT检测模式将是广大IVD厂商争相进入的领域。

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